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  分子催化  2018, Vol. 32 Issue (3): 268-275
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引用本文 

付磊涵, 谢宗波, 李红霞, 龚俊源, 乐长高. α-糜蛋白酶催化合成β-脲基巴豆酸酯[J]. 分子催化, 2018, 32(3): 268-275.
FU Lei-han, XIE Zong-bo, LI Hong-xia, GONG Jun-yuan, LE Zhang-gao. α-Chymotrypsin-catalyzed Synthesis of β-Uramino Crotonic Ester[J]. Journal of Molecular Catalysis (China), 2018, 32(3): 268-275.

基金项目

国家自然科学基金(Nos.21462001,21262002,21465002)、江西省科技计划项目(No.20161BCB24006)、江西省教育厅科技项目(Nos.KJLD14050,GJJ150584)资助

作者简介

付磊涵(1993-), 男, 硕士生

通讯联系人

谢宗波, E-mail:zbxie@ecit.cn

文章历史

收稿日期:2018-03-19
修回日期:2018-04-19
α-糜蛋白酶催化合成β-脲基巴豆酸酯
付磊涵, 谢宗波, 李红霞, 龚俊源, 乐长高     
东华理工大学 应用化学系, 江西 南昌 330013
摘要β-脲基巴豆酸酯是合成6-甲基嘧啶二酮衍生物及3,4-二氢嘧啶二酮衍生物的重要中间体,在生物制药中有着广泛的应用.由于酶具有绿色、安全、高效的催化特性,采用α-糜蛋白酶为生物催化剂,以N,N-二甲基甲酰胺为反应介质,37℃条件下,通过1,3-二羰基化合物和脲的缩合反应,合成了一系列β-脲基巴豆酸酯类化合物.
关键词:α-糜蛋白酶    β-脲基巴豆酸酯    生物催化    酶的非专一性    
α-Chymotrypsin-catalyzed Synthesis of β-Uramino Crotonic Ester
FU Lei-han, XIE Zong-bo, LI Hong-xia, GONG Jun-yuan, LE Zhang-gao     
Department of Applied Chemistry, East China University of Technology, Nanchang 330013, China
Project supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21462001, 21262002, 21465002), the Science and Technology Projects of Jiangxi (No. 20161BCB24006), the Science and Technology Foundation of the Jiangxi Education Department (Nos. KJLD14050, GJJ150584)
Fu Lei-han(1993-), male; postgraduate
Abstract: β-Uramino crotonic esters are important intermediate for the synthesis of 6-methylpyrimidinedione derivatives and 3, 4-dihydropyrimidinedione derivatives, and they have a wide range of applications in biopharmaceuticals. Enzymes have green, safe and highly efficient catalytic properties, so a series of β-uramino crotonic esters was synthesized via the α-chymotrypsin-catalyzed condensation reaction between 1, 3-dicarbonyl compounds and ureas at 37℃ and in DMF medium.
Key words: α-chymotrypsin     β-uramino crotonic ester     biocatalysis     promiscuity    

β-脲基巴豆酸酯是合成6-甲基嘧啶二酮衍生物及3, 4-二氢嘧啶二酮衍生物的重要中间体, 6-甲基嘧啶二酮衍生物具有选择性抗肿瘤、抗病毒、抗结核和抗真菌活性[1-2], 而3, 4-二氢嘧啶二酮衍生物具有钙通道阻断[3]、抗菌[4]和抗病毒[5]等生物活性.但关于β-脲基巴豆酸酯合成的报道却很少, 虽有报道用氯化锑[6]、三氟甲磺酸锌[7]和盐酸[8]等作催化剂合成该类物质, 但反应条件较苛刻, 所以寻找温和的合成方法仍具有积极意义.酶作为生物体内大量生化反应的催化剂, 其绿色、安全、高效的催化性能已得到化学家们的广泛关注, 并将酶的非专一性运用到多种有机合成反应中且取得了较好的效果[9-12], 例如水解酶的天然功能是催化化学键的断裂, 然而近些年来的研究表明, 水解酶同样可催化化学键的形成[13-14], 并已成功应用于C—C[15-16]键、C-杂[17-18]原子键的构建及氧化[19]、过氧化[20]、聚合[21]等多种类型的化学反应中.于是, 我们以α-糜蛋白酶为生物催化剂, 通过1, 3-二羰基化合物和脲的缩合反应, 合成了一系列β-脲基巴豆酸酯类化合物, 反应过程如图 1所示.

图 1 β-脲基巴豆酸酯的合成 Figure 1 Synthesis of β-uramino crotonic ester
1 实验部分 1.1 试剂与仪器

乙酰乙酸乙酯(AR, 98%)、丙酰乙酸甲酯(AR, 98%)、丁酰乙酸乙酯(AR, 97%)、尿素(AR, 99%)、硫脲(AR, 99%)、N-甲基脲(AR, 98%)、氘代DMSO(氘代率99.9% +体积分数0.03% TMS)和α-糜蛋白酶(800 usp U/mg), 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 其它试剂均为国产AR.所有试剂使用前未经任何处理.

WRS-2A型微机熔点仪, 上海仪电物理光学仪器有限公司(使用前温度未经校正, 起始温度为60 ℃, 升温速率为1 ℃/min); Bruker AV Ⅱ-600型核磁共振波谱仪, 瑞士Bruker公司, 扫场范围为1H: -1~14 ppm, 13C: -10~230 ppm. LTQ-XL型线性离子阱质谱仪, 美国Thermo-Fisher公司, 配有Xcalibur型数据处理系统, 甲醇(美国Fisher公司), 质谱扫描范围m/z 50-500;喷雾电压为1.0 kV, 金属毛细管温度150 ℃, ESI喷雾气(N2)压力1.0 MPa, 载气(N2)压力为0.2 MPa; 萃取剂通过进样泵进样, 流速3 μL/min; 串联质谱分析时, 母离子的隔离宽度1.0 μm, 碰撞时间30 ms, 碰撞能量20%;其他参数由LTQ-MS系统自动优化.

1.2 β-脲基巴豆酸酯的合成

在10 mL具塞锥形瓶中, 加入3 mmol乙酰乙酸乙酯、1 mmol尿素、20 mg α-糜蛋白酶和3 mL N, N-二甲基甲酰胺, 于37 ℃恒温摇床(200 r/min)中反应48 h, 经硅胶填充的吸附柱色谱分离(Vpetroleum ether: Vethyl acetate=2:1)得到目标产物, 并用1H NMR和HR-MS进行了结构表征, 产率为柱色谱分离产率.

2 结果与讨论 2.1 催化剂对酶促反应的影响

催化剂是影响反应的关键因素, 所以研究了酶的种类对反应的影响, 以乙酰乙酸乙酯和尿素作为模板反应来研究各种酶的催化效率, 在相同的反应条件下, 只有α-糜蛋白酶能催化乙酰乙酸乙酯和尿素反应, 得到33%的β-脲基巴豆酸酯, 结果见表 1.因此, 选择α-糜蛋白酶作为最佳催化剂进行后续研究.

表 1 不同酶对模板反应的催化效果a Table 1 The catalytic effect of various enzymes for the model reactiona
2.2 溶剂对酶促反应的影响

溶剂是影响化学反应的重要因素, 因此又考察了溶剂对模板反应的影响.由表 2可知, α-糜蛋白酶在DMF和DMSO等非质子溶剂催化活性较好, 最高可取得33%的产率; 而在甲醇、乙醇和水等质子溶剂无产物生成, 这可能是溶剂影响了酶的活性和稳定性所致, 而溶剂Log P值对反应的影响并无明显的规律性, 最终选择DMF为溶剂进行后续研究.

表 2 溶剂对模板反应产率的影响a Table 2 Effect of solvent on the yield of model reactiona
2.3 底物摩尔比对酶促反应的影响

选用乙酰乙酸乙酯和尿素为模板反应底物, 首先考察了底物摩尔比对反应效果的影响, 结果见表 3.尿素过量时反应效果较差, 而随着乙酰乙酸乙酯用量的增加产率不断提高, 当乙酰乙酸乙酯:尿素=3:1时产率取得最大值33%, 之后, 再增加乙酰乙酸乙酯用量产率反而降低.所以选择了乙酰乙酸乙酯:尿素=3:1为最佳底物摩尔比.

表 3 底物摩尔比对模板反应产率的影响a Table 3 Effect of molar ratio on the yield of model reactiona
2.4 温度对酶促反应的影响

温度不仅影响化学反应速率, 也是影响酶活性的重要因素, 因此又考察了温度对模板反应的影响, 结果见表 4.随着温度升高反应产率也逐渐升高, 当温度为37 ℃时产率取得最大值, 之后再升高温度产率反而降低.因为酶是生物催化剂, 过高的温度会使酶蛋白变性失活, 从而影响其催化性能, 导致反应产率降低.因此, 最终选择37 ℃作为最佳反应温度.

表 4 温度对模板反应产率的影响a Table 4 Effect of temperature on the yield of model reactiona
2.5 催化剂用量对酶促反应效果的影响

最后又对催化剂用量进行了优化, 结果见表 5.不加催化剂时, 没有产物生成, 当用5 mg的α-糜蛋白酶作催化剂时, 取得了7%的产率; 当酶用量增加至20 mg时, 产率达到了最大值.因此, 最终选择20 mg为最佳酶用量.

表 5 催化剂用量对模板反应产率的影响a Table 5 Effect of enzyme loading on the yield of model reactiona
2.6 β-脲基巴豆酸酯类化合物的合成

在确定了酶促反应的最佳条件后, 又选取了一系列β-二羰基化合物和脲进行反应, 以考察该方法的底物普适性.由表 6实验数据可知, α-糜蛋白酶可以催化多种二羰基化合物和脲的缩合反应合成β-脲基巴豆酸酯类化合物; 同时也可以看出二羰基化合物和脲的结构对反应产率有较大影响.硫脲的反应效果较尿素和甲基脲好, 且产率受二羰基化合物结构影响较小(表 6, 序号2, 5, 8);当二羰基化合物与甲基脲反应时, 区域选择性较好, 分别只得到了Ⅲc1、Ⅲf1和Ⅲi1(表 6, 序号3, 6, 9);丁酰乙酸乙酯与脲反应时的产率相对较低, 可能是受空间效应的影响(表 6, 序号7, 8).

表 6 α-糜蛋白酶催化合成β-脲基巴豆酸酯a Table 6 α-Chymotrypsin-catalyzed synthesis of β-uramino crotonic estersa

Ⅲa:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.14 (s, 1H), 6.80 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 4.06 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.18 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C7H12N2O3 + H]+计算值: 173.085, 测定值: 173.091.

Ⅲb:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 11.09 (s, 1H), 6.90 (s, 2H), 5.45 (s, 1H), 4.06 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.18 (t, J=7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C7H12N2O2S+ H]-计算值: 187.062, 测定值: 187.053.

Ⅲc1:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.87 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 4.77 (s, 1H), 4.06 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.77 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 1.19 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C8H14N2O3 + H]+计算值: 187.100, 测定值: 187.108.

Ⅲd:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.13 (s, 1H), 6.80 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.84 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C7H12N2O3 + H]+计算值: 173.085, 测定值: 173.092.

Ⅲe:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 11.13 (s, 1H), 7.10 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.84 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.19 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C7H12N2O2S + H]+计算值: 188.062, 测定值: 188.059.

Ⅲf1:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.65 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.84 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.75 (s, 3H), 1.20 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C8H14N2O3 + H]+计算值: 187.100, 测定值: 187.107.

Ⅲg:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.14 (s, 1H), 6.80 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 4.05 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.01 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.18 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C9H16N2O3 + H]+计算值: 201.116, 测定值: 201.123.

Ⅲh:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 11.14 (s, 1H), 7.10 (s, 2H), 4.75 (s, 1H), 4.05 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.01 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.18 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C9H16N2O2S + H]-计算值: 215.093, 测定值: 215.034.

Ⅲi:白色固体. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 10.25 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.05 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.76 (s, 3H), 2.01 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.18 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H). ESI -HRMS: m/z, [C10H18N2O3 + H]+计算值: 215.132, 测定值: 215.139.

2.7 反应机理的推测

α-糜蛋白酶属于肽酶S1族的丝氨酸蛋白酶, 由3个通过二硫键链接的多肽链组成, A链(Cys1-Leu13), B链(Ile16-Tyr146)和C链(Ala149-Asn245), A链是13个残基的短链, 而B和C链分别含有131和97个残基[22].催化三联体由His57、Asp102和Ser195组成[23-24].参照相关文献[25], 推测出了α-糜蛋白酶催化合成β-脲基巴豆酸酯类化合物的可能机理.如图 2所示, His57先夺取脲氨基上的质子, 使脲作为亲核试剂进攻被Ser195通过氢键活化了的羰基, 生成一个过渡态的化合物, 之后再通过Ser195发生脱水生成β-脲基巴豆酸酯.

图 2 α-糜蛋白酶催化合成β-脲基巴豆酸酯的可能机理 Figure 2 Proposed mechanism for α-chymotrypsin-catalyzed synthesis of β-uramino crotonic ester
3 结论

我们建立了一种生物催化合成β-脲基巴豆酸酯类化合物的新方法, 并对可能的催化机理进行了推测; 该方法反应条件较为温和, 符合绿色化学的基本理念; 但该方法的产率还较低, 底物适用范围也有待拓展.该研究进一步拓展了酶非专一性的应用范围, 对推动生物催化在有机合成中的应用具有积极意义.

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