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  分子催化  2021, Vol. 35 Issue (4): 328-334
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引用本文 

张凡凡, 夏仕文, 谢永芳, 刘姣, 林晖. 类产碱假单胞菌XW-40发酵-生物转化级联产生D-脯氨酸[J]. 分子催化, 2021, 35(4): 328-334.
ZHANG Fan-fan, XIA Shi-wen, XIE Yong-fang, LIU Jiao, LIN Hui. Fermentation-biotransformation Cascade for the Production of D-proline by Pseudomonas pseudolcaligenes XW-40[J]. Journal of Molecular Catalysis (China), 2021, 35(4): 328-334.

基金项目

重庆市研究生科研创新项目(CYS20270)

作者简介

张凡凡(1995-), 女, 硕士研究生, 生物催化与生物转化方向

通讯联系人

夏仕文, E-mail: xiasw@cqupt.edu.cn

文章历史

收稿日期:2021-05-15
修回日期:2021-06-20
类产碱假单胞菌XW-40发酵-生物转化级联产生D-脯氨酸
张凡凡1 , 夏仕文1 , 谢永芳1 , 刘姣1 , 林晖2     
1. 重庆邮电大学 生物信息学院, 大数据生物智能重庆市重点实验室, 重庆 400065;
2. 河南农业大学 生命科学学院, 河南 郑州 450002
摘要:建立了一个新颖的用于产生D-脯氨酸的发酵-生物转化过程.发酵过程中,以DL-脯氨酸为发酵前体,类产碱假单胞菌XW-40利用L-对映体诱导产生脯氨酸脱氢酶,D-对映体完全保留.在最优条件下,发酵阶段产生6 g/L D-脯氨酸.生物转化过程中,细胞不经分离,发酵液直接作为反应介质.采用分批补料策略实现DL-脯氨酸中L-对映体的转化.DL-脯氨酸单批补料浓度为10 g/L,补料次数达到5批.通过发酵和生物转化的级联,累积的D-脯氨酸浓度达到31 g/L,ee>99%.推测了生物转化过程中D-脯氨酸产生的反应机理.
关键词类产碱假单胞菌XW-40    发酵    生物转化    D-脯氨酸    脯氨酸脱氢酶    
Fermentation-biotransformation Cascade for the Production of D-proline by Pseudomonas pseudolcaligenes XW-40
ZHANG Fan-fan1 , XIA Shi-wen1 , XIE Yong-fang1 , LIU Jiao1 , LIN Hui2     
1. Chongqing Key Laboratory of Big Data for Bio-intelligence, College of Bioinformatics, Chongqing University of Posts and Telecommunications, Chongqing 400065, China;
2. School of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: A novel fermentation-biotransformation cascade was developed for the production of D-proline. In the fermentation process with DL-proline as the precursor, the L-enantiomer was used to induce the production of proline dehydrogenase by Pseudomonas pseudoalcaligenes XW-40, while the D-enantiomer was completely retained. Under the optimal conditions, 6 g/L D-proline was produced in the fermentation stage. In the biotransformation process, the fermentation broth is directly used as the reaction medium without further separation of cells. The conversion of L-enantiomer in DL-proline was realized by fed-batch strategy. The feeding concentration of DL-proline in a single batch was 10 g/L, and the feeding times reached 5 batches. Through the cascade of fermentation and biotransformation, the D-proline was accumulated with 31 g/L and more than 99% enantiomeric excess. The mechanism of D-proline production in biotransformation was also postulated.
Key words: Pseudomonas pseudoalcaligenes XW-40    fermentation    biotransformation    D-proline    proline dehydrogenase    

D-脯氨酸是抗偏头痛药物依来曲普坦(Elet-riptan)的关键手性中间体. D-脯氨酸的制备方法主要包括: 1)化学不对称转换法. 该法以L-脯氨酸为原料, 正丁醛为催化剂, 正丁酸为溶剂, 与L-酒石酸反应制备D-脯氨酸·L-酒石酸盐, 然后在甲醇中用氨水处理得到D-脯氨酸[1]. 该法是目前D-脯氨酸的工业生产方法, 但存在生产成本高, 环境污染大的缺点; 2)生物法. Bernegger-Egli等以L-精氨酸为原料通过重氮化合成L-2-氯精氨酸, 利用Pseudomonas aeruginosa自动突变体中的L-2-氯脒基水解酶将L-2-氯精氨酸水解为(S)-2-氯鸟氨酸, 然后自动反转、关环为D-脯氨酸[2]. 该法的总收率为13%, ee > 98%. 日本协和发酵采用生物降解法制备D-脯氨酸. 利用假丝酵母PRD-234菌株同化L-脯氨酸, 发酵液中D-脯氨酸浓度达到50 g/L, ee 99.5%, 收率47%[3].

脯氨酸脱氢酶是一种黄素酶, 广泛存在于人体、植物和微生物中[4]. 脯氨酸脱氢酶在L-脯氨酸的代谢途径中, 以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶催化L-脯氨酸脱氢为Δ1-吡咯啉-5-羧酸(P5C). 目前对微生物脯氨酸脱氢酶的研究主要侧重于酶的分离纯化、结构表征和功能研究[5-11], 脯氨酸脱氢酶的生物技术应用局限于构建生物传感器[12-13]和生物燃料电池[14], 用于D-脯氨酸的制备尚未见报道.

我们以DL-脯氨酸为发酵前体, 类产碱假单胞菌XW-40在发酵过程中利用其中的L-脯氨酸诱导产生胞内脯氨酸脱氢酶, D-脯氨酸完全保留. 发酵产生的细胞不经分离, 发酵液直接作为生物转化反应介质. 生物转化阶段, 采用分批补料策略, 利用细胞中的脯氨酸脱氢酶催化DL-脯氨酸中的L-对映体转化. 通过发酵和生物转化的级联实现D-脯氨酸的高效产生.

1 实验部分 1.1 实验材料

类产碱假单胞菌XW-40系本实验室从土壤中筛选, 保藏于中国典型培养物保藏中心, 保藏号为CCTCC NO: M2015521. D-脯氨酸、L-脯氨酸、DL-脯氨酸为南京红杉生物科技有限公司馈赠, 乙酰葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司, 其余试剂均为市售分析纯或化学纯.

1.2 实验方法 1.2.1 培养基

培养基1(g/L): 蛋白胨5, 酵母膏5, 氯化钠1, pH 6.5; 培养基2(g/L): 蛋白胨3, 酵母膏3, 氯化钠5, 牛肉膏1, DL-脯氨酸20, pH 7. 培养基3(g/L): 蛋白胨3, 酵母膏3, 氯化钠5, 牛肉膏1, L-脯氨酸10, pH 7.

1.2.2 种子培养

取斜面保存的类产碱假单胞菌XW-40菌种接种于5 mL培养基1中, 30 ℃、180 r/min下恒温摇床振荡培养48 h.

1.2.3 摇瓶发酵

将培养基1中培养液作为种子, 按10%接种量接种于50 mL培养基2中, 30 ℃、180 r/min下恒温摇床振荡培养48 h.

1.2.4 生物转化

50 mL发酵液, 用2 mol/L盐酸溶液调整pH至7.5, 加入0.5 g DL-Pro, 30 ℃、180 r/min下反应, HPLC检测反应过程.

1.2.5 L-脯氨酸转化产物的鉴定

将培养基1中培养液作为种子, 按10%接种量接种于100 mL培养基3中, 30 ℃、180 r/min下恒温摇床振荡培养48 h. 将发酵液离心, 弃上清, 保留细菌细胞. 将细菌细胞悬浮于4 mL 100 mmol/L磷酸盐(pH 7.5)中备用. 8 mL 100 mmol/L磷酸盐(pH 7.5)中加入2 mL细胞悬浮液(130 mg干重细胞)和0.1 g L-脯氨酸, 30 ℃、180 r/min下反应60 h, HPLC检测是否反应完全. 反应液留存备用.

2, 4-二硝基苯肼显色法. 取上述反应液, 离心留上清. 取1 mL上清液与1 mL 1 mmol/L 2, 4-二硝基苯肼混合, 37 ℃下水浴加热20 min, 冷却至室温. 加入5 mL 1.5 mmol/L NaOH溶液混匀并静置5 min, 观察颜色变化.

薄层色谱法. 取上述反应液, 离心留上清. 加入0.5 mL 30%高氯酸, 离心, 去除上清液中的蛋白质. 上清液中加入0.5 mL 30%双氧水, 混合均匀. 用2 mol/L K2CO3溶液中和至pH 7左右. 在硅胶板上用苯酚∶水(75∶25, v/v)展开, 茚三酮溶液显色. L-谷氨酸钠溶液作对照.

1.2.6 L-谷氨酸生物转化

8 mL 100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中加入2 mL细胞悬浮液(130 mg干重细胞)和0.1 g L-谷氨酸钠, 30 ℃、180 r/min下反应60 h, HPLC检测.

1.2.7 分析方法

发酵液中的生物质浓度采用分光光度法在600 nm处测量. 1个OD600相当于0.43 mg干重细胞.

发酵和生物转化过程中L-Pro、D-Pro和转化产物, L-Pro转化率采用柱前手性衍生-HPLC分离和测定. 取1 mL发酵液或转化液, 12 000 r/min离心1 min弃细胞. 取100 μL上清液, 加入150 μL水, 250 μL三乙胺乙腈溶液(4 g/L)和500 μL乙酰葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)乙腈溶液(2 g/L), 30 ℃下衍生30 min, 离心. 上清液采用HPLC法在Alltech高效液相色谱仪上测定. 色谱柱: Sepax MAH-C18(250×4.6 mm, 5 μm), 流动相: 0.1%三氟乙酸水溶液/甲醇(49/51, v/v), 流速: 1 mL/min, 检测波长: 254 nm, 柱温: 25 ℃. L-Pro·GITC、D-Pro·GITC的保留时间分别为14.9、17.8 min. L-脯氨酸转化率=(1-AL/AD×1.5)×100%, D-脯氨酸的对映体过量(ee)=(AD-AL)/(AD+AL)×100%. 其中AL、AD分别为L-Pro·GITC和D-Pro·GITC的峰面积. DL-Pro中L-Pro·GITC和D-Pro·GITC的峰面积比为1∶1.5.

2 结果与讨论 2.1 类产碱假单胞菌XW-40发酵

采用单因素法对类产碱假单胞菌XW-40的培养基组分进行优化. 考察了蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和NaCl对细胞生长和DL-脯氨酸中L-对映体转化率的影响. 结果如图 1. 结果表明, 各个组分的最适浓度分别为: 蛋白胨3 g/L, 牛肉膏1 g/L, 氯化钠5 g/L, 酵母膏3 g/L.

图 1 培养基组分对细胞生长和转化率的影响 Fig.1 Effect of medium component on cell growth and conversion Except for variables, other conditions are the same as the experimental section
a. peptone; b. beef extract; c. NaCl; d. yeast extract
2.2 培养条件优化 2.2.1 初始pH值和温度对细胞生长和转化率的影响

考察了培养基初始pH对类产碱假单胞菌XW-40细胞生长和DL-脯氨酸中L-对映体转化率的影响. 由图 2a可知, 当pH过高或是过低都不利于类产碱假单胞菌XW-40细胞的生长和L-脯氨酸的转化. 当初始pH值为7时, 细胞生长最好, L-脯氨酸转化率最高. 考察了培养温度对类产碱假单胞菌XW-40的生长以及L-脯氨酸转化率的影响(图 2b). 由图 2b可知, 从20 ℃开始, 细胞生物量和转化率随温度的升高而升高, 在30 ℃达到最大值; 超过30 ℃, 细胞生物量和转化率迅速降低. 为此选择30 ℃作为类产碱假单胞菌XW-40的发酵温度.

图 2 初始pH和温度对转化率和细胞生长的影响 Fig.2 Effect of initial pH (a) and temperature (b) on conversion and cell growth a. Fermentation broth(50 mL) contained 3 g/L yeast extract, 1 g/L beef extract, 3 g/L peptone, 5 g/L NaCl, 20 g/L DL-Pro. pH 5.0~7.5, 30 ℃, 48 h, 180 r/min; b. Fermentation broth(50 mL) contained 3 g/L yeast extract, 1 g/L beef extract, 3 g/L peptone, 5 g/L NaCl, 20 g/L DL-Pro. pH 7.0, 20~40 ℃, 48 h, 180 r/min
2.2.2 发酵时间对细胞生长和L-脯氨酸转化的影响

对菌体生长及L-脯氨酸转化曲线的测定有利于确定最佳发酵时间. 由图 3可知发酵时间为48 h时, 细胞生长基本停止, 但L-脯氨酸的转化率仍在上升. 当发酵时间为72 h时, 转化率接近100%. 提示细胞在生长过程中产生胞内脯氨酸脱氢酶. 细胞停止生长后, 胞内脯氨酸脱氢酶继续催化L-脯氨酸降解.

图 3 发酵过程中细胞生长和DL-脯氨酸转化的时间进程 Fig.3 Time course of cell growth and conversion of DL-Pro in fermentation Fermentation broth(50 mL) contained 3 g/L yeast extract, 1 g/L beef extract, 3 g/L peptone, 5 g/L NaCl, 20 g/L DL-Pro. pH 7.0, 30 ℃, 180 r/min
2.3 发酵和生物转化级联 2.3.1 发酵前体浓度优化

在发酵过程中, 当发酵前体DL-脯氨酸浓度小于12 g/L时, L-脯氨酸的转化率没有明显下降, 可见在此发酵前体浓度下, 细胞生长和脯氨酸脱氢酶的产生不受D-脯氨酸的抑制. 当发酵前体浓度大于12 g/L时, 细胞生长受到抑制, L-脯氨酸转化率随发酵前体浓度增大逐渐下降(图 4). 为此, 选择12 g/L为发酵前体DL-脯氨酸浓度.

图 4 DL-脯氨酸浓度对转化率和细胞生长的影响 Fig.4 Effect of DL-proline concentration onconversion and cell growth Fermentation broth(50 mL) contained 3 g/L yeast extract, 1 g/L beef extract, 3 g/L peptone, 5 g/L NaCl, 4~20 g/L DL-Pro. pH 7.0, 30 ℃, 48 h, 180 r/min
2.3.2 发酵液pH对生物转化的影响

类产碱假单胞菌XW-40在发酵过程中产氨, 发酵液pH上升至9.0, 该pH非生物转化的最适pH. 为此, 我们考察了发酵液pH对生物转化的影响(图 5). 从图 5可知, 生物转化的最适pH为7.5.

图 5 生物转化阶段pH对转化率的影响 Fig.5 Effect of pH on conversion in biotransformation Fermentation broth (10 mL), pH 7.0~9.5, 10 g/L DL-Pro, 30 ℃, 48 h, 180 r/min
2.3.3 分批补料产生D-脯氨酸

为提高类产碱假单胞菌XW-40细胞的利用率和D-脯氨酸的产生效率, 采用分批补料的策略产生D-脯氨酸(图 6). 以12 g/L DL-脯氨酸为发酵前体, 类产碱假单胞菌XW-40发酵48 h后, 调整发酵液的pH为7.5, 补料10 g/L DL-脯氨酸. 每批补料的L-脯氨酸转化完全后, 继续补料. 分批补料5批, 累计加入DL-脯氨酸50 g/L. L-脯氨酸转化完全, 累积的D-脯氨酸浓度达到31 g/L, ee大于99%. 类产碱假单胞菌XW-40细胞在长达384 h的操作时间里表现出高的脯氨酸脱氢酶活性, 有待进一步深入研究.

图 6 分批补料产生D-Pro Fig.6 Fed-batch production of D-Pro from DL-Pro in fermentati-on-biotransformation cascade Fermentation broth (10 mL), 12 g/L DL-Pro, pH 7.5, 30 ℃, 180 r/min. 10 g/L DL-Pro was fed at the indicated time intervals
2.4 生物转化反应机理推测

采用柱前手性衍生HPLC对类产碱假单胞菌XW-40细胞催化L-脯氨酸的转化产物和L-4-氨基丁酸、L-谷氨酸进行了对照. 转化产物既不是L-4-氨基丁酸, 也不是L-谷氨酸, 证明L-脯氨酸的转化途径中没有脯氨酸氧化酶参与.

采用2, 4-二硝基苯肼显色法对转化产物进行鉴定, 发现显色液呈红棕色, 表明L-脯氨酸的转化产物含有醛基或酮基(图 7a). 进一步地, 转化产物采用双氧水氧化, 经TLC分析, 证实其氧化产物为L-谷氨酸(图 7b). 因此, 推断L-脯氨酸在类产碱假单胞菌XW-40细胞中的脯氨酸脱氢酶(ProDH)作用下转化为γ-谷氨酸半醛(γ- glutamic semialdehyde, GSA).

图 7 L-脯氨酸转化产物的2, 4-二硝基苯肼显色和双氧水氧化产物的薄层色谱 Fig.7 Chromogenic reaction of GSA with DNP and TLC of oxidizing product of GSA by H2O2 a. GSA-DNP (left), control (right); b. L-Glu(left), oxidizing product of GSA by H2O2 (right)

以L-谷氨酸为底物, 采用类产碱假单胞菌XW-40细胞转化时, 转化产物与L-脯氨酸的转化产物相同, 均为GSA, 但未观察到L-脯氨酸的形成(图 8). 说明L-谷氨酸在γ-谷氨酸半醛合成酶(亦称为吡咯啉-5-羧酸合成酶, P5CS)作用下转化为GSA. 转化产物中没有L-脯氨酸存在, 一个可能的原因是ProDH活性远高于吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)活性.

图 8 L-脯氨酸(a)和L-谷氨酸(b)转化产物的HPLC图谱 Fig.8 HPLC profile of GSA from L-Pro (a) and L-Glu(b)

类产碱假单胞菌XW-40细胞中存在L-脯氨酸合成和降解酶系. L-脯氨酸在ProDH作用下转化为Δ1-吡咯啉-5-羧酸(P5C), P5C与GSA处于平衡中. P5C在P5CR作用下还原为L-脯氨酸. 相对于L-脯氨酸脱氢途径, 还原途径的反应是限速步骤; P5C在吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(P5CDH)作用下, 转化为L-谷氨酸. L-谷氨酸在P5CS作用下转化为P5C. 相对于P5C合成途径, 其脱氢途径的反应是限速步骤. 结合L-脯氨酸在植物和微生物中的合成和代谢途径[15-16], 推测其反应机理如下(Scheme 1).

图示1 类产碱假单胞菌XW-40催化DL-脯氨酸产生D-脯氨酸的反应机理推测 Scheme 1 Postulated mechanism for the production of D-proline from DL-Proline by Pseudomonas pseudoalcaligenes XW-40
3 结论

以DL-脯氨酸为发酵前体, 类产碱假单胞菌XW-40细胞在发酵过程中利用L-脯氨酸诱导产生胞内脯氨酸脱氢酶, D-脯氨酸完全保留. 类产碱假单胞菌XW-40发酵的最适培养基成分为: 蛋白胨3 g/L, 牛肉膏1 g/L, 氯化钠5 g/L, 酵母膏3 g/L, DL-脯氨酸(发酵前体)12 g/L. 最适培养条件为: 初始pH 7.0, 温度30 ℃, 发酵时间48 h. 发酵液中的细胞不经分离, 直接用于生物转化. 生物转化阶段的最适pH值为7.5, DL-脯氨酸的单批补料浓度为10 g/L, 分批补料批次达到5批. 采用发酵-生物转化级联方式和转化阶段分批补料策略, D-脯氨酸累积量达到31 g/L, ee值大于99%. 类产碱假单胞菌XW-40细胞中存在同时L-脯氨酸合成酶系和降解酶系, 其中脯氨酸脱氢酶和P5C合成酶占主导地位. 我们建立的方法为D-脯氨酸的生物法工业化制备提供了一条新颖的途径.

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