2024, Vol. 38
抗菌材料是近二十多年来迅速发展起来的具有抑制或杀灭其表面细菌能力的一种新型功能材料[1]. 含有抗菌材料的各种制品具有自洁功能, 对预防疾病, 保护人类健康具有十分重要的意义[2]. 抗菌剂的开发和应用为保护人类健康竖起了一道绿色屏障, 目前常用的抗菌剂仍然以载银抗菌剂为主, 虽然该类抗菌剂已经获得了较广泛的应用[3−5], 但其依然存在以下几方面劣势: (ⅰ)由于银原料的价格非常昂贵, 导致载银抗菌剂的成本一直居高不下, 限制其在各领域的广泛推广; (ⅱ)载银抗菌剂中的银离子具有很强的光敏反应, 遇到光会还原变成灰色, 同时银离子还会跟材料中的硫、卤素反应而变成浅褐色或褐色, 并且随着银离子浓度不同其变色程度也不同, 且变色是不可控的, 从而限制了它的应用范围; (ⅲ)抗真菌和霉菌效果较差, 故在接触人体和潮湿等环境中的应用受到一定限制; (ⅳ)由于目前纳米银抗菌剂的安全性尚未通过美国FDA(Food and Drug Administration)和欧盟REACH(Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemi-cals)的认可, 认为其可能导致水体中银浓度超过0.5 mg·mL−1而造成水体重金属污染. Wu等[6]通过在塑料表面引入亲水基团进行改性, 然后将Ag锚定在塑料表面, 该载银抗菌塑料虽然对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌均具有较好的杀菌效果, 然而随着实验次数的增加, 抗菌性能慢慢减弱直至完全消失, 抗菌持久性难以得到保证. 此外, 如果它被人体内脏吸收还会累积进而发生病变. 虽然载银抗菌剂的活性成分是银离子, 但其中也不可避免有少量纳米银的存在, 故其安全性依然受到质疑. 因此, 开发可替代载银抗菌剂的新型非银抗菌剂, 已成为抗菌领域亟需解决的技术难题, 具有十分重要的理论意义和实用价值.
铜元素是人体内一种不可缺少的微量元素, 具有能够维持正常造血功能、促进结缔组织形成等重要作用, 铜元素含量不足时将引发疾病, 而且铜相对于银来说, 价格低廉易得, 因此, 铜杀菌剂可作为替代载银抗菌剂之一. 在无公害水果生产中都把铜杀菌剂列为推荐保鲜杀生药剂. Xu等[7]利用超声水热法制备了TiO2/Cu复合材料, 研究表明, 该复合材料不仅对有机污染物具有很好的光催化降解效率, 而且对大肠杆菌也具有较好的抗菌性能, 抑菌率达到99.75%. 此外, 由于铜抗菌剂低毒、安全、不易产生抗性、杀菌广谱, 对真菌和细菌有效, 环境友好. 欧美等国家已禁止使用纳米银作为抗菌剂, 目前已开始使用纳米铜等作为替代, 同时纳米铜抗菌剂也已通过美国FDA和欧盟REACH的认可.
光催化型无机抗菌剂大多属于半导体氧化物, 由于其化学性质稳定并且对人体危害小而备受关注. 作为一种有前景的氧化物光催化剂, 钙钛矿(分子通式为ABO3)由于其电子结构、能带结构和表面缺陷可调, 因此, 在光催化抗菌领域得到广泛研究[8−9]. 如Swamy等[10]发现Eu掺杂的LFO对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌效果. Liu等[11]发现在LaCoO3 的A和B位分别掺杂Ce和Al可以提高氧空位的形成, 从而促进氧气和水分子的吸附, 进而显著提高光催化抗菌效率(从46.8%提高到98.8%). Bolognino等[12]发现Cu掺杂的LFO在降解抗生素方面也具有良好的效果. 本研究通过先掺杂取代和后原位析出的设计方法成功制备出Cu修饰的LFO抗菌剂, 并对其进行抗菌实验评价, 结合多种表征手段探究含Cu催化剂的抗菌机制.
1 实验部分 1.1 抗菌催化剂的制备LFO的制备: 采用超声辅助溶胶-凝胶法制备LaFeO3纳米颗粒[13]. 在30 mL去离子水中加入4.33 g La(NO3)3·6H2O(AR)和4.04 g Fe(NO3)3·9H2O (AR), 然后在超声波水浴中60 ℃水浴1 h, 此溶液命名为A溶液. 同时, 将3.84 g柠檬酸(AR)溶于20 mL去离子水中, 磁力搅拌器剧烈搅拌, 得到均匀的溶液命名为B溶液. 持续超声下, 将B溶液缓慢加入到溶液A中, 温度控制在60 ℃左右, 维持3 h直至溶液混合物完全转化为凝胶. 随后, 将溶胶在80 ℃的烘箱中干燥12 h. 然后将干燥的凝胶研磨, 在马弗炉中200 ℃(升温速率为: 5 ℃·min−1)下空烧12 h. 最后, 样品在600 ℃(升温速率为: 5 ℃·min−1)下煅烧5 h, 得到LaFeO3, 记为LFO.
LCFO的制备: Cu掺杂LaFeO3(LCFO)纳米粒子的合成与LFO基本相似，除加入上述A溶液外, 还需加入0.048 g Cu(NO3)2·3H2O(AR), 其它过程完全相同, 得到的样品记作LCFO.
LCFO-12h的制备: 将合成的LCFO置于瓷舟中放在管式炉中, 在5% H2/N2气氛下升温至450 ℃ (升温速率: 5 ℃·min−1)并保持12 h, 制备出Cu修饰的LaFeO3样品, 记为LCFO-12h.
1.2 抗菌性能测试通过革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S. aureus, ATTCC6538)和革兰氏阴性大肠杆菌(E. coli, ATTCC8739)平板计数法去测定样品的抗菌效率. 实验前, 将所需的玻璃器皿、营养琼脂和生理盐水经过高压灭菌. 其他塑料物品、凝固后的琼脂板以及材料通过紫外线灭菌. 首先, 向5 mL 的 LB 肉汤中加入 100 μL 的原始细菌悬浮液, 放置于37 ℃恒温摇床中培养达到指数生长期. 采用稀释平板涂布法定量评估样品的抗菌活性. 即将3.2 mg 的样品加入1 mL的生理盐水制成样品液, 在 500 μL 样品液中加入500 μL 的大肠杆菌悬浮液(108 CFU·mL−1), 与样品充分接触, 在 37 ℃ 培养箱中孵育24 h 后将菌液进行梯度稀释. 最后, 取 100 μL 稀释后的大肠杆菌菌悬液涂抹在营养琼脂板上, 并在 37 ℃ 下孵育12 h . 之后, 对菌落进行拍照并计算不同样品的抗菌率. 对于金黄色葡萄球菌, 与大肠杆菌的操作相同, 只需将金黄色葡萄球菌与样品的接触的量改为300 μL 样品液中加入700 μL 的菌液, 接触时间改为 12 h , 金黄色葡萄球菌均匀涂布在营养琼脂板的孵育时间改为 16 h. 抗菌率R依据公式R= [(A1−A2)/A1] × 100%计算, 其中A1为空白组中的菌落数, A2为实验组中的菌落数.
1.3 统计分析所有实验至少进行3次, 所有数据均表示为平均值±标准偏差(SD). 采用单因素方差分析进行统计分析, 各组之间的显著性差异(P)程度用*表示, *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001.
1.4 抗菌催化剂的表征X-射线衍射分析(XRD), X-射线粉末衍射实验在日本Rigaku Ultima Ⅳ 型X射线粉末衍射仪上进行. 测试条件为: 管电流15 mA, 管电压30 kV, Cu(Kα) (λ =
通过SEM、TEM和HRTEM对样品LCFO-12h的形貌进行表征(图1). 从图1(a)中可以看出, LCFO-12h样品具有规整的形貌和网状结构, 每个网孔直径约为50~200 nm. 图1(b)为LCFO-12h样品的TEM图像, 很明显地观察到Cu纳米颗粒的存在, 颗粒的直径小于10 nm, 呈现高度分散的状态并且很好地锚定在LFO表面. 从图1(c)的HR-TEM中测得的晶格间距分别为0.277和0.207 nm, 对应于LFO和Cu的(121)和(111)晶面[14−15]. 对LCFO-12h的高角度环形暗场扫描图像进行相应的EDS分析研究各元素的分布(图1(d−g), 可以看出, La、Fe、O、Cu均匀分布在LCFO-12h表面, 说明样品是由La、Fe、O、Cu组成的.
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图 1 LCFO-12h的SEM (a), TEM (b), HRTEM (c)和EDS mapping (d−g)图 Fig.1 SEM (a), TEM (b), HRTEM (c) and EDS mapping (d−g) of LCFO-12h |
通过XRD对三种抗菌剂的物相结构进行了表征, 结果如图2所示. 衍射峰2θ位于22.6°、25.3°、32.2°、39.7°、46.1°、51.6°、57.4°、67.4°、72.0°和76.5°分别归属于正交钙钛矿结构(JCPDS card No. 01-074-2203) LFO的(002)、(111)、(112)、(022)、(004)、(114)、(204)、(400)、(314)和(116)晶面, 这与先前的文献报道相一致[16]. Cu2+掺杂后, 衍射峰(121)向低角度略微偏移, 这是由于Cu2+(0.073 nm)半径略大于Fe3+(0.065 nm)半径, Cu2+成功取代了Fe3+引起了晶胞膨胀. 掺杂后LCFO具有完整的钙钛矿型结构, 这是因为掺杂的Cu2+半径与Fe3+相近, 所以掺杂原子只是进入了LaFeO3晶格的结点位置, 并没有改变其晶型. 进一步在H2气氛中还原后, 观察到一个弱峰(绿色方框, 2θ = 43.3°), 这归属于金属铜的衍射峰[17], 这一结果说明在还原条件下Cu成功地从LCFO中析出.
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图 2 所制备样品LFO、LCFO、LCFO-12h的XRD图 Fig.2 XRD spectra of the sample LFO, LCFO, LCFO-12h |
光吸收和能带结构对光催化剂的活性有显著影响. 通过UV-Vis DRS来测定样品LFO、LCFO和LCFO-12h的光学性质. 从图3可以看出, 在600~800 nm处, 所有样品都出现了明显的吸收带, 吸收归属于LaFeO3从价带(VB)到导带(CB)的特征电子跃迁, O 2p→Fe 3d[18]. 掺杂Cu2+后, 在600~800 nm波长范围内LCFO光吸收强度增强, 这可能是由于Cu离子成功进入LFO晶格产生的氧空位和局域能级有关[19]. 此外, LCFO经过H2还原后, LCFO-12h样品在600~800 nm光吸收强度进一步增强, 这是由于LCFO经过H2还原后表面Cu颗粒析出Cu的局域表面等离子体效应所引起的, 这与先前的文献报道相一致[20].
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图 3 所制备LFO、LCFO 和LCFO-12h的UV-Vis DRS光谱图 Fig.3 UV-Vis DRS spectra of the samples LFO, LCFO and LCFO-12h |
X射线吸收光谱测试(XANES)可以用来深度探究材料的电子结构和几何结构. 对制备的LCFO、LCFO-12h催化剂和Cu箔片, CuO样品进行XAS测试分析. 样品图4显示了LCFO和LCFO-12h 中的Cu L-edge XANES光谱. 与金属Cu和CuO的参考样品相比, LCFO在933和953 eV出现两个强峰, 光谱特征类似于CuO参考样品, 表明LCFO中的铜以Cu2+形式存在[21]. LCFO被还原后得到的LCFO-12h样品与Cu的XANES谱图相似[21], 说明Cu2+成功被掺杂后, 进一步被还原析出Cu, 以Cu(0)形式存在LFO表面.
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图 4 所制备样品LCFO 和 LCFO-12h中Cu L-edge XANES光谱图 Fig.4 Cu L-edge XANES spectra of the samples LCFO and LCFO-12h |
图5为样品LFO、LCFO和LCFO-12h分别与108 CFU·mL−1 E. coli共培养24 h以及S. aureus共培养16 h后的两种细菌的平板涂布实拍图片. 从结果可以明显看出, LFO对S. aureus和E. coli的杀菌效果并不明显(图6). 而掺杂Cu2+后的LCFO抗菌效果明显增强, 对S. aureus和E. coli的抗菌率分别达到99.7%、99.8%. 从图5中不难看出, LCFO对E. coli的灭菌效果低于对S. aureus, 这归结于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞壁结构和组成的差异. 前者外部具有多层膜, 可以作为选择性渗透屏障, 避免外来分子的渗透; 而后者只有一层厚厚的肽聚糖细胞壁, 可以很容易地被穿透[22]. 而LCFO-12h对于两种细菌的杀灭效果最强, 在规定接触时间内几乎能将S. aureus和E. coli全部杀灭, 抗菌率均接近100%(图6), 最终效果优于TiO2/Cu复合材料对大肠杆菌的抗菌性能(抑菌率达到99.75%)[7], 说明掺杂Cu2+的LFO以及还原Cu2+得到Cu修饰的LFO均能很好地抑制E. coli和S. aureus的生长, Cu修饰的LFO具有更好的杀菌效果.
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图 5 样品的平板涂布实拍图(a)金黄色葡萄球菌, (b)大肠杆菌 Fig.5 Plate coated real picture of samples (a) S.aureus and (b) E. coli |
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图 6 样品的平板计数计算结果(a)金黄色葡萄球菌, (b)大肠杆菌(ns.表示无显著差异) Fig.6 Results of plate counting of samples were calculated for (a) S. aureus and (b) E. coli |
通过以上研究, 推测并提出了LCFO-12h可能的光催化抗菌机理. LFO是半导体, 本身对细菌没有杀伤能力. 在光照条件下, LFO吸收光能被激发形成电子-空穴对(e−-h+)对, 即吸收光能导致电子从价带跃迁到导带, 同时在价带留下空穴. 光生空穴h+与催化剂表面的H2O结合, 生成强氧化性羟基自由基(•OH); 光生电子e−与表面的氧分子反应生成超氧化物离子(•O2−)自由基[23−30]. 同时, 由于Cu具有等离子体共振效应, 增强了对光的吸收. LFO吸光后产生的电子和空穴寿命相对较长, 但也容易直接复合消失. 由于表面Cu粒子与LFO的相互作用, e−从LFO迁移到Cu 粒子上成为Cu捕获的e−, 避免了h+和e−的复合, 提高了h+和e−的利用率. 这些具有强氧化性的自由基可以和细菌新陈代谢所需的部分酶(MO)结合, 从而破坏细菌的细胞壁或者细胞膜的渗透性、DNA结构, 造成电子传递中断而使微生物致死, 如图7所示.
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图 7 LCFO-12h光催化抗菌机理图 Fig.7 Proposed photocatalytic antibacterial mechanism of LCFO-12h catalyst |
利用先取代和后原位析出法成功制备出Cu修饰的钙钛矿LFO抗菌剂, 该抗菌剂对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较好的光催化抗菌性能, 在规定接触时间内几乎能将S. aureus和E. coli全部杀灭, 抗菌率均接近100%, 说明Cu修饰的钙钛矿LFO具有良好的光催化抗菌效果. 其原因可能是: LFO表面成功析出的纳米Cu具有等离子体共振效应, 增强了对光的吸收; Cu纳米粒子和LFO之间的相互作用使得产生的e−从LFO向Cu表面进行转移, 从而提高电荷分离效率, 抑制了e−和h+的复合, 进而提高了光催化抗菌效率.
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