2024, Vol. 38
2. 中国农业科学院 油料作物研究所, 湖北 武汉 430000
2. Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan , 430000, China
酶是一类天然的生物催化剂, 具有绿色、高效、催化条件温和等优点[1−2], 在食品改良[3−4]、药物合成[5−6]、生物燃料开发和农业废料处理[7]等领域具有广泛的应用前景[8−9]. 然而, 酶在高温、高压、强酸、强碱等极端条件下易失活; 传统机械搅拌带来的高剪切力易破坏酶的结构; 酶易溶于水, 难以从体系中分离和回收利用, 制约了大规模的工业化应用[10]. 通过将酶固载到多孔固体材料中, 提高酶的稳定性, 便于回收利用[11], 甚至提高催化活性[12], 是酶工业化应用的有效解决方案. 近年来, 固定化酶技术得到了快速发展, 水凝胶[13]、活性炭[14]、介孔二氧化硅[15]、金属有机框架(MOFs)[16]和COFs[17]等新型多孔材料[18]被广泛用于固定化酶载体进行研究.
水凝胶、活性炭等材料存在结构不稳定和酶易泄露的问题; MOFs材料容易浸出金属离子且难以固定大尺寸的酶分子, 使用范围存在一定的局限性[19]. COFs作为一种新兴的结晶多孔聚合物, 自2005年由Yaghi等首次报道以来引起广泛关注, 在气体分离和存储、催化[20]、化学传感[21]、生物医学应用[22]和离子导体等[23]领域取得了令人瞩目的进展. COFs由有机结构单元共价连接而成, 形成高度有序的二维(2D)或三维(3D)网络结构[24]. 通过精心设计可以制备出具有不同孔隙大小和形状的COFs材料, 特殊的官能团还可以提高COFs与酶的相容性, 提供酶催化所需的微环境[25]; 高孔隙率和连续稳定的孔道结构, 有利于底物传质, 提高反应速率. 这些“定制化”特点使得COFs材料为酶的固定化提供了更好的平台, 是固定化酶的理想载体材料[26].
我们对近10年来COFs材料在固定化酶领域的应用进行了系统分类和综述, 主要讨论了COFs固定化酶的优势, 详细介绍了物理吸附、共价连接以及包埋固定酶的方法细节, 及其应用(表1)[27−50], 以期对未来固定化酶载体的设计和应用提供参考.
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表 1 报道的部分COFs固定化酶应用 Table 1 Part of COFs reported for immobilized enzyme application |
随着研究的不断深入, 研究人员制备了大量的 COFs材料, 连接方式和合成方法各有差异, 以下将从这两方面进行介绍.
1.1 COFs的连接键COFs主要由非金属轻量元素(C、H、O、N和B等)组成, 通过强共价键连接形成拓扑结构, 并通过对连接单元的预先设计, 实现定制化的组成、成分和功能, 使其具备理想的孔隙结构以及理化特性[51]. 目前报道的COFs的稳定性主要取决于合成中使用的共价连接单元, 这些共价键是可逆或部分可逆的, 在生长过程中发生重排纠错, 形成有序结构[52]. 根据COFs连接单元之间的共价键的不同, 主要可以分为含硼类、三嗪环类以及亚胺类COFs(图1). 含硼类COFs材料具有高度结晶性和可调控的孔结构, 通常由含有硼氧键的化合物作为构建单元组装而成, 但硼氧键在水、弱酸和碱性条件下并不稳定性, 一定程度上限制其在固定化酶领域的应用[53−54]. 三嗪类COFs通常具有良好的溶剂稳定性、热稳定性, 使其在吸附、分离和催化等领域具有良好的性能[55]. 与其他COFs相比, 三嗪类COFs的结晶度和比表面积相对较低, 限制了其在某些吸附和催化反应中的活性和效率[56]. 亚胺键是研究最多的一类连接方式, 亚胺类[57]COFs材料稳定性适中, 单体数量众多, 可以实现对孔隙、形状和化学特性的调控, 经过氢键异构化或还原反应后稳定性进一步提高[58]. 目前, 亚胺键COFs是固定化酶的研究与应用主流材料[59].
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图 1 COFs的主要成键类型 Fig.1 The major bond type of COFs |
目前, 已报道了多种COFs的合成方法[60], 如溶剂热法[61]、室温合成法[62]、微波法[63]、超声化学法[64]、离子热法[65]、机械化学合成法等[66] 、界面合成法[67]. 其中, 溶剂热法[61]需要单体在密封容器中高温(80~130 ℃)反应3~7 d. 温度和压力对于溶剂热法制备的COFs材料的结晶度起着关键作用, 单体的溶解度和反应可逆性也对晶体成核和生长速率等具有决定性的影响. 室温合成法[62]是近年来开发的一种操作简单且更加环保的合成方法[68], 不需要苛刻的合成条件, 适合规模化制备COFs材料, 但材料的结晶性较差. 微波法[63]是一种以微波照射作为替代能源的方法, 具有反应速度快、产物结晶度高、产率高等优势[69]. 相较于其他方法, 微波法可以跟踪反应进程, 控制反应的温度和压力, 是一种简单、经济的合成手段. 超声化学法[64]通过超声波辐照使溶液产生震荡和剧烈的气泡形成和坍塌, 从而引发化学反应, 超声波的机械效应和热效应能够促进反应物之间的混合和扩散, 加快反应速率. 离子热法[70]具有反应条件可调控、反应速率较快、产物纯度较高的优点, 离子液体还可以对反应过程起到模板作用, 促进COFs的形成和稳定. 机械化学合成法[66]是一种简单、安全、环保的合成方法, 通常使用球磨研磨仪或振荡球磨仪等装置进行反应, 但合成的COFs结晶度和孔隙率略差. 界面合成法[71]通常使用两种或更多种不同的前体分子, 将它们置于界面上进行反应, 可在较温和的条件下进行, 避免了高温或强酸碱条件可能引发的副反应, 是一种简单且可重复的合成方法. 综上所述, COFs的合成方法多种多样, 各有特点, 未来还会开发出更多新方法, 以满足不同领域对COFs材料的需求.
2 COFs固定化酶的方法自2015年Banerjee等[27]首次发表有关介孔COFs固定胰蛋白酶(trypsin)的研究以来[72], COFs固定化酶的研究趋势稳定增长, 展现出巨大的潜力(图2). 根据酶和载体的不同连接方式, COFs固定化酶方法主要分为: 物理吸附、共价连接和包埋[73].
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图 2 COFs固定化酶近10年研究进展(来自Web of Science) Fig.2 Recent progress on COFs in immobilized enzymes in recent 10 years (from Web of Science) |
通过范德华力、氢键或静电相互作用将酶吸附在COFs的表面或孔隙中[74], 是目前应用最为广泛的固定化方法. 这种方法反应条件温和, 适用于多种COFs材料, 得到的固定化酶具有较高的固载量和生物催化活性. 然而, 由于COFs孔道尺寸限制, 能够吸附的酶种类有限, 同时, 物理吸附的结合力较弱[75], 在重复利用或洗涤过程中酶易发生泄漏.
2015年, Banerjee等[27]首次采用物理吸附法制备了COFs固定化酶的复合材料. 通过无模板法一步合成中空介孔球形COF-DhaTab, 采用物理吸附法将与孔径大小接近的trypsin固载到COF-DhaTab的孔道中(图3(a)), 固载量可达15.5 μmol·g−1. 在N-苯甲酰-L-精氨酸4-硝基苯胺(BAPAN)水解过程中, 固定化酶活性仅为游离酶的60%(表2), 这可能是由于底物与孔道中的酶传质受阻所致.
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图 3 (a) COF-DhaTab制备示意图[27]; (b) COF-ETTA-EDDA 合成示意图[29] Fig.3 (a) Preparation of COF-DhaTab[27]; (b) The synthetic procedure for COF-ETTA-EDDA[29] |
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表 2 Trypsin和COF-DhaTab固定化酶的动力学参数 Table 2 Kinetic parameters of trypsin, and trypsin immobilized in COF-DhaTab |
2018年, 马胜前等[28]使用二甲氧基对苯二甲醛(DMTP)和 1,3,5-三(4-氨基苯基)-苯(TPB)合成一种新型的介孔COFs -OMe. 通过物理吸附法固定脂肪酶PS, 用于1-苯乙醇手性拆分. 为了研究不同材料对孔隙微环境和固载酶的影响, 将其与具有相似孔径和空间结构的COF-V、介孔硅(MCM-41)、介孔MOF(PCN-128)进行比较, 结果表明介孔COFs材料对酶具有更好的亲和力, 稳定有序的孔通道不仅易于酶的扩散和固定, 还可以避免酶的失活. 接着将疏水性COFs-OMe和具有羟基亲水官能团的COF-ONa、COF-OH进行对比, 发现疏水的孔隙环境有利于酶分子的扩散和生存, 固载量和稳定性也更高(表3).
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表 3 6种固定化酶的结构参数, 固载量和1-苯乙醇动力学拆分性能 Table 3 Structural parameters, solid loading, and dynamic kinetic resolution of 1-phenylethanol of six immobilized enzyme materials |
2019年, 马胜前团队[29]通过调整COFs的孔隙结构, 合成了分层多孔 COFs(COF-ETTA-EDDA)材料(图3(b)). 采用物理吸附法将脂肪酶PS固定在COF-ETTA-EDDA较大的孔, 较小的孔隙用于底物和产物传递. 在酶促仲醇动力学拆分中, 分层双孔COFs在80 min可转化50%, 单孔COFs需要100 min, 而游离酶15 h转化率仅15%, 证明COF-ETTA-EDDA具有高效的催化能力和对底物更好的亲和力. 接着又通过催化三酰基甘油酯与脂肪酸乙酯的酯交换反应, 证明分层多孔COFs催化效率更高, 解决制备生物柴油时副产物导致孔道堵塞、抑制催化效率的问题, 同时增强酶对有害副产物和变性剂的抵抗力.
2020年, Sahu等[32]通过缩合反应制备TPMM COFs, 将α-淀粉酶通过物理吸附法固定在TPMM COFs中, 制备了一种用于淀粉分解的高效生物催化剂, α-淀粉酶的固载量约为550 mg·g−1, 固定后TPMM COFs的比表面积从135.29 m2·g−1减少到99 m2·g−1. 由于TPMM COF载体的保护作用, 固定化的α-amylase相比游离酶表现出更高的热稳定性和重复使用性, 在10次循环后仍保持了74%的初始活性. 在酶动力学中, 固定化酶的Km值低于游离酶, 表明固定化酶的亲和力更高. (表4)
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表 4 游离和固定化α-淀粉酶的动力学参数 Table 4 Kinetic parameters for free and immobilize α-amylase |
2022年, Wei等[30]通过1,3,5-三糖醛和邻苯二酚胺(BTDH)缩合合成COF-BTDH, 通过氢键固定果胶酶(pectinase)得到COF-BTDH@pectinase, 固载量为0.8 mg·g−1, 提高酶的催化效率. Niu等[31]用2,3,5,6-四氨基苯醌(TABQ)和六水环己烷(HKH)合成富含丰富碳基的二维导电COF1, 通过氢键将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定, 制备玻碳电极(GC)/COF1/(AChE). COF1的碳基活性位点能够促进酶的固定并提高酶的活性, 继而产生更强的电流信号. 该生物传感器用于对氧磷酸甲酯的检测, 检测限(LOD)为1.4 ng·mL−1, 具有灵敏度高, 性能稳定的优点.
这些研究表明物理吸附法制备COFs固定化酶的复合材料固载量较高, 能够提高酶活性, 具有溶剂耐受性、热稳定性和重复使用性, 为生物催化领域的研究和应用提供了有潜力的新途径[76−77].
2.2 共价连接酶分子表面存在的羧基、氨基、环氧基等官基团, 可以通过共价键与COFs表面存在官能团链接[78]制备固定化酶. 经共价键连接的COFs固定化酶具有更高的稳定性和重复使用性, 不存在酶泄漏的风险, 但共价连接可能会导致酶结构的扭曲, 酶活会一定程度的下降[79]. 因此, 在选择固定化酶的方法时, 需权衡各种因素, 并根据具体应用需求做出选择.
2017年, Shen等[35] 通过热溶剂法在磁性石墨烯(MG)表面用1,3,5-三甲酰基间苯三酚(Tp)和1,4-二氨基苯(Pa-1)生长COFs, 制备了一种由COFs包覆MG的新型载体(MG@TpPa-1), 以戊二醛为偶联剂, 共价连接trypsin, 获得MG@ TpPA-1-trypsin(图4(a)), 负载量高达268 μg·mg−1. 成功应用于模型蛋白和真实样品trypsin的消化, 在5 min内可鉴定出牛血清蛋白68个肽段, 序列覆盖率为89%, 甚至在2 min内实现对BSA的完全消化. 重复12次实验后, BSA序列覆盖率仍高达86%, 展现经共价键连接的COFs固定化酶优异的稳定性和重复使用性.
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图 4
(a) MG@ TpPA-1-trypsin合成[35] ; (b) Biomolecule |
2018年, 马胜前等[36]使用1,3,5-三-(4-氨基苯基)三嗪(TAPT)和 1,2,4,5-苯四酸酐(PMDA)进行缩合反应, 制备了比面积为714 m2·g−1, 孔隙大小为3.7 nm的COF 1. 采用1-乙基-3( 3-二甲胺丙基) 碳二酰亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为交联剂, 将一系列生物分子上(溶菌酶、三肽、氨基酸)的氨基与COF 1进行共价偶联, 形成Biomolecule
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表 5
COF 1, Lysozyme |
2019年, Esteves等[37]研究了不同固定化方法对酶固载量和催化活性的影响. 使用1,3,5-三甲酰基间苯三酚(TFP)和四(4-氨基苯基)甲烷(TTA)缩合制备亚胺键连接的COFs(PPF-2), 在合成过程中过量添加TTA或TFP单体, 在材料表面预留了醛基(PPF-2-CHO)或氨基(PPF-2-NH2)用于酶的固定化. 作者探索了3种固定化方法: PPF-2-CHO共价连接脂肪酶, 得到固定化酶CALB@PPF-2-CHO; 将环氧氯丙烷作为交联剂共价连接PPF-2-NH2和脂肪酶, 得到CALB@PPF-2-NH2; 采用物理吸附法得到CALB@PPF-2(图4(c)). CALB@PPF-2-NH2的固载量最高(3.9 mg·g−1), CAL-B@PPF-2和CAL-B@ PPF-2-CHO的固载量分别为3.1和1.2 mg·g−1, 在油酸与乙醇酯化反应中均表现出比游离酶更高的催化活性(表6)、热稳定性和重复使用性. 尽管物理吸附可以实现酶的高效固定, 但共价键结合的固定化酶具有更好的催化活性、热稳定性和重复使用性.
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表 6 CAL-B@PPF-2和游离酶对油酸酯化反应的催化性能 Table 6 Catalytic performance of CAL-B@PPF-2 and free enzyme on oleic acid esterification reaction |
2021年, Tang等[38] 用TAPB和DMTP通过界面合成法制备H-COF-OMe复合材料, 以戊二醛为偶联剂共价连接漆酶(Laccase)获得Lac@H-COF-OMe, 固载量有67 mg·g−1, 对四环素的降解率高达99%, 重复使用10次后降解率仍有91%. 2022年, Wang等[39]制备一种核壳结构的磁性Fe3O4@COF材料, 通过戊二醛共价连接辣根过氧化物酶(HRP), 制备一种Fe3O4@COF@HRP生物传感器, 用于检测对苯二酚. 该生物传感器具有良好的检测分析性能力, 检测范围为0.5~300 mmol·L−1, LOD为0.12 μmol·L−1, 并成功应用于自来水和天然水中对苯二酚的检测, 具有良好的回收率.
2.3 包埋固定化酶包埋是将酶通过混合、浸渍或共沉积等方法嵌入固体材料中, 形成固定化酶[80]. 包埋法具有不改变酶的结构, 不受酶分子大小的限制, 利用多孔载体的屏蔽效应, 实现酶活性最大程度的保存[81]. 但是, COFs的合成条件求苛刻, 目前采用直接包埋的方法制备固定化酶仍比较困难.
2.3.1 牺牲模板法2020年, 陈瑶等[43]提出了一种用MOFs作为牺牲模板, 二次构筑COFs胶囊包埋酶的新策略(图5(a)). 首先选择温和条件下可降解的MOFs作为牺牲模板, 通过仿生物矿化法固定酶; 然后以MOFs为核, 在表面生长COFs外壳, 得到三明治结构; 最后在温和的条件下降解MOFs, 对酶“松绑”, 将其释放到COFs的胶囊内腔中, 首次制备了可定制化的酶@COF“核壳胶囊反应器”, 催化性能提高超过300%. 这种新型策略同样适用于多种酶和多酶级联体系. 2021年, Wang等[44]使用可降解的ZIF-90作为牺牲模板, 制备HRP封装的中空COF胶囊(HRP@COF), 建立了一种肉眼检测SARS-CoV-2 RNA的比色方法(图5(b)). 该方法还可用于临床样本的分析, 并可成功区分COVID-19患者与健康人群. 2023年, Lin等[45]使用相同策略, 将葡萄糖氧化酶(GOx)和细胞色素c(Cyt c)共同封装在 COF 胶囊中, 构建 GOx-Cyt c@COF(图5(c)), 级联催化活性较游离酶提高约 1.6 倍, 并用于测定血清中的葡萄糖.
2.3.2 无模板法
牺牲模板法具有较强的通用性和适用性, 但合成步骤相对繁琐, 某些模板可能会与COFs结构紧密结合, 导致模板残留, 模板分子的形状和大小也会限制COFs的孔隙结构. 2022年, Yang等[46]创建了一种无模板方法, 在室温下将酶原位包埋在中空COFs材料中(图6(a)). 以Trypsin为模型制备, COFs微晶从内核迁移并在外壁自组装, 从而将酶保留在空腔中形成Trypsin@COF-LZU1, 其生物活性比游离酶高约30%. 此外, 在高温、有机溶剂、螯合物、变性剂等各种极端条件下均表现出优异的活性和稳定性. 基于这种方法, 还制备了GOx@COF胶囊用于电化学传感, 检查人血清中的葡萄糖, 具有高选择性和优异的使用性能. 该研究不仅为COFs包埋酶提供了新途径, 而且在生物催化和生物传感方面具有潜在应用, 使人造细胞器成为可能.
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图 6 (a) Trypsin@COF-LZU1胶囊的制备图[46]; (b) Enzyme@aCOF的自修复和结晶过程示意图[47] Fig.6 (a) The Preparation Diagram of the Trypsin@COF-LZU1 Capsule[46], (b) Schematic illustration of enzyme@aCOF via self-repairing and crystallization process[47] |
2023年, Wang等[47]设计一种在自修复和结晶过程中将酶包裹在COFs中的预保护策略. 初始生长阶段酶被装载在低结晶aCOFs中, 为酶提供有效的保护; 随后酶在aCOFs自修复和结晶过程继续包埋, 转化为高结晶多孔COFs. 通过该方法, 将葡萄糖氧化酶(GOx)包埋在COFs中, 制备GOx@COF(图6(b)). 该预保护策略不仅使酶免受恶劣反应条件的影响, 同时不限制酶的大小. 采用不同大小和表面电荷的酶以及双酶级联系统证明了预保护策略的多功能性, 提供将酶包裹在多孔载体中的设计思路, 有望开发高性能固定化生物催化剂.
为了将更多的酶嵌入到孔径较小的COFs中, Kim等[48]使用共沉积法制备了GOx@COF复合材料 . 首先, 在深共晶溶剂(DES)溶液中, 用Tp将GOx功能化, 得到醛基化的GOx(GOx-CHO). 然后, 通过席夫碱反应, 将Pa 或TAPB和Tp共价连接, 成功构建了GOx@COF复合材料(分别为GOx@Tp-Pa和GOx@Tp-TAPB), 这种方法显著提高了酶的耐受性、稳定性和催化活性.
2020年, Dong等[49]用热溶剂法合成了一种纳米级核壳结构微球Fe3O4@DhaTph-lipase, 所制备的微球作为乳化剂来稳定Pickering乳液, 形成一个乳液液滴微反应器. 通过可见光诱导的光热转化来促进双相油水界面的酶促酯化反应, 具有良好的催化活性、重复使用性, 经过10次循环后, 酯化率仍高达97%. 这种形成乳液液滴微反应器为COFs固定化酶的合成开辟了新的途径.
综上, COFs作为载体, 可以通过物理吸附、共价连接和包埋等方法将酶固载, 制备固定化酶. 物理吸附操作简单, 但适用酶种类受限于 COFs孔径, 酶与COFs之间的结合力较弱, 易脱落, 固定化酶的稳定性较低. 共价连接具有更好的稳定性和重复使用性, 但COFs表面需要有官能团, 同时, 共价链接容易造成酶结构变化, 导致酶活性下降. 包埋法可以最大程度保存酶的活性, 防止酶泄露, 但合成条件相对苛刻, 目前路线较长, 操作复杂. 因此, 在选择固定化酶的方法时, 需权衡各种因素, 并根据具体应用需求做出相应选择.
3 以COFs为载体固定化酶的应用COFs作为一种很有发展前景的酶固定化平台. 随着进一步的结构设计和功能扩展, 将开发出更多结合COFs和酶优势的生物复合材料[82−83]. 接下来, 将介绍COFs固定化酶在酶促酯化、手性拆分、分子检测、肿瘤治疗和蛋白水解等应用方面的最新进展.
3.1 酶促酯化2023年, Wang等[50]利用Pickering乳液微液滴作为软模板, 在乳液界面进行COFs纳米微球(COF-MCs)的有序组装, 将酶分子封装在液滴内部, 然后通过乳液滴表面的COFs颗粒交联, 制备出交联多孔COFs微胶囊(COF-MCs-SH, 图7). 该催化剂在己酸与己醇的酯化反应中, 2 h内产率达到95%, 游离酶仅有27%, 表观活性较游离酶提高了10.9倍. COFs微胶囊暴露于蛋白酶, 24 h后仍有98%的初始活性, 证明COFs的保护作用. 应用于连续流体系, 催化效率(CE)高达5.17 U·mg−1, 较间歇反应提高1.56倍; 连续高效生产己酸己酯72 h后仍保持97%的产率. 该方法实现了酶分子的高效可控封装, 在有机介质的间歇反应和连续流动体系中均表现出优异的性能, 展现出工业生产应用的潜力.
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图 7 交联微胶囊CALB@COF-MCs-SH的制备[50] Fig.7 Fabrication of COF based porous microreactors with crosslinked shells(CALB@COF-MCs-SH) [50] |
2019年, 季一兵等[40]用三聚氰胺和对苯二甲醛合成了一种席夫碱基COFs(SNW-1), 将其与二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)通过聚合获得poly(GMA-EDMA-SNW-1)整体柱, 用戊二醛作为偶联剂连接纤维素酶(cellulase)得到cellulase@poly(GMA-EDMA-SNW-1)(图8), 为毛细管电色谱(CEC)提供一种新的手性固定相. 其分辨率和保留时间的相对标准差(RSD)均低于6.8%和4.5%, 在30 d内运行60次后, 分辨率没有明显变化(仅从2.13到1.99), 具有较好稳定性和重复使用性, 并对8种不同的手性药物均表现出良好的对映体分离效果.
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图 8 Cellulase@poly(GMA-EDMA-SNW-1)整体柱的制备[40] Fig.8 Fabrication of cellulase@poly(GMA-EDMA-SNW-1)capillary monolithic column[40] |
2019年, Song等[41]提出一种由氨醛缩合反应制备的COFETTA-TPAL, 将微过氧化物酶-11(MP-11)和葡萄糖氧化酶(GOD)用于比率电化学葡萄糖生物传感(图9). COFETTA-TPAL为二维(2D)纳米片, 具有高度有序的晶体共轭结构, 比表面积为423.14 m2·g−1, 双孔隙分别为3.06和0.87 nm. MP-11和GOD通过孔隙装载到COFETTA-TPA上, 同时MP-11和GOD的羧基与载体上的N原子结合产生氢键, 生成GOD-MP-11/COFETTA-TPAL/GCE系统, 用于葡萄糖检测的电化学生物传感器. 该生物传感器具有高选择性和优异的葡萄糖传感性能, 其检测限为4.97 μmol·L−1, 线性范围为0.017 ~3 mmol·L−1, 显示出良好的重现性和稳定性.
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图 9 ETTA-TPAL合成和GOD和MP-11自组装示意图[41] Fig.9 Schematic illustration of COFETTA-TPAL synthesis and the assembly both GOD and MP-11 into the pores of COFETTA-TPAL[41] |
2022年, Wang等[34]采用溶剂热法在多壁碳纳米管(MWCNTs)表面原位合成COF-DhaTab, 将AChE吸附在材料的表面, 制备AchE/COF@MWCNTs/GCE生物传感器(图10), 用于马拉硫磷的定量分析. 在最佳条件下, 该生物传感器的线性范围为1 nmol·L−1~10 μmol·L−1, 马拉硫磷的检测限为0.5 nmol·L−1, 具有良好的抗干扰能力、重现性和存储稳定性. 该生物传感器检测水和菠菜等样品中的马拉硫磷, 准确率高于96%, 证明该生物传感器可应用于有机磷农药的测定和环境监测.
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图 10 (a) COF@MWCNTs的合成途径, (b) AchE/COF@MWCNTs/GCE生物传感器检测原理[34] Fig.10 (a) Synthesis route of COF@MWCNTs, (b) Detection principle of AchE/COF@MWCNTs/GCE biosensor[34] |
2021年, Tang等[33]通过静电相互作用把GOx和过氧化氢酶(CAT)吸附在COFs上, 制备COF@GOx&CAT, 用于肿瘤细胞的长期饥饿治疗和光动力治疗. GOx和CAT的固载量分别为46.1和392.58 μg·mg−1, 将其置于磷酸缓冲溶液、MEM细胞培养基等不同介质中浸泡24 h后仍具有良好的稳定性. 细胞实验中, 经COF@GOx&CAT处理后的肿瘤细胞仅保留17%的活性, 高于COF@CAT(48%)和COF@GOx(27%), 表现出对肿瘤细胞强大的抑制作用. 小鼠实验中, 经COF运输的GOx和CAT, 延长了酶在肿瘤组织中的保留时间, 有效抑制了肿瘤生长.
3.5 蛋白水解2021年, Lin等[42]通过调控催化剂的添加量, 用4,4′,4″-(1,3,5-三嗪-2,4,6-三基)三苯胺(Tat)和2,3-二羟基对苯二甲醛(Dha)合成中空微管TatDha-COF, 将Ni2+与COF的羟基和三嗪基团螯合, 为trypsin固定提供结合位点, 成功制备COF(Ni)@trypsin. 由于Ni2+和trypsin固定在孔隙通道, 中空微管的比表面积由2 607减少到1 242 m2·g−1, 孔隙体积从1.14减少到0.49 cm3·g−1. 固定后的trypsin活性为30 μmol·(L·g·min)−1, 较游离酶提高10%; 相同条件下水解蛋白, COF(Ni)@trypsin耗时(5 min)仅为游离酶的(约12 h)的1/144, 显著提高蛋白水解效率(表7). 经消化乳蛋白评价, COF(Ni)@ trypsin鉴定出44个肽, 高于游离酶(鉴定出18个肽), 在消化方面表现出对复杂样品的良好适用性, 稳定性和重复使用性.
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表 7 Trypsin固定前后BAPNA和蛋白质的水解性能 Table 7 Performance of BAPNA and protein degradation by trypsin before and after immobilization |
我们综述了近十年来COFs做为载体材料, 制备固定化酶的研究进展. 目前, COFs材料被成功应用于固定化酶, 具有增强酶的抗逆性能、提高酶的稳定性和重复使用性, 取得了非常好的效果. 但相比于其他多孔材料, 这方面研究才刚刚起步, 依然面临非常大的挑战: COFs的合成条件较为苛刻, 缺乏大批量的制备方法, 导致COFs作为固定化酶载体难以实现产业化应用; COFs在酸性条件下易解离, 失去对酶的保护作用, 需要继续提高材料的稳定性; COFs固定化酶在医学、食品等领域的生物安全性仍需要更加深入的研究.
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